2022.9.23改訂(2009.9.9)
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概要
HPLCのリテンション・タイムを分子の構造式のみから予測するには、カラムの固定相への溶解と移動相への溶解をハンセンの溶解度パラメータを用いて評価すれば良い。
基本原理は液液抽出と同じだろう。
分子の大きさ用いた補正が有効であった。
内容
この記事は、化学工業社、化学工業2010年9月号に『クロマトグラフとハンセン溶解度パラメータ」として掲載されたものだ。
HPLC関係以外を別ページに分離した。（2022.9）
1. 緒言：
クロマトグラフは、混合物の分析方法としては、無くてはならない分析方法である。
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、溶媒に溶けやすく，比較的分子量が大きい，耐熱性が低い化合物の分析に使われる。ガスクロマトグラフィー（GC）は蒸発しやすい化合物の分析に使われる。
HPLCもGCもマススペクトルと組み合わせるなどして，あるピークの分子構造を特定している。
しかし，何故，化合物がこの順番に出てくるか，ピークの分解能を広げるにはどうしたら良いかに関しては余り説明されていない。
本稿では，こうしたクロマトグラフのリテンション・タイム(RT)を、ハンセンの溶解度パラメータ法を用いて検討する方法を紹介する。
2. クロマトの原理とハンセンの溶解度パラメータ（HSP）
HPLC分析で一番多用されるカラムはODSカラムであろう。これは微細なシリカゲルの表面を、オクタデシルシランで修飾したもので、ここに溶離液に溶かした試料を流す。
すると、オクタデシル基に溶けやすいものは、カラムの充填剤と強く相互作用して遅く出てくる。
同時にキャリアーに溶けやすいものは早く出てくる。それを模式図的に表すと下図に示すようになる。
GCの場合，分解能の高さから，最近の傾向としてはパックド・カラムよりは，キャピラリー・カラムが多用される。
これは多くの場合、ポリジメチルシロキサンの液膜が、細いガラス管の内側にコートされた構造を取る。
分離の主体が液体なのでGLCと表記される事もある。
この場合も、試料がポリジメチルシロキサンに溶解しやすいか，そこから蒸発しやすいかの違いによって混合物が分離する。
これらの固定相に対する溶解性、溶離液に対する溶解性を、ハンセンの溶解度パラメータ（HSP）を用いて解析する。
ハンセンの溶解度パラメータ（HSP）
Hansenの溶解度パラメーター（HSP）は蒸発潜熱のエネルギーを、分散項(dD)、分極項(dP)、水素結合項(dH)の３つに分解し、３次元のベクトルとしてとらえる。
HSP空間とHSPベクトル
そして，固定相（移動相）のHSPベクトルと試料のHSPベクトルが近い場合に，”似たものは似たものを溶かす“という原理によって溶解しやすくなると判断する。ベクトルの類似度に関しては，通常のベクトル間の距離の計算法とは少し異なる(1)式を用いる。
HSP距離
HSP 距離(Ra)={4*(dD1-dD2)^2 + (dP1-dP2)^2 +(dH1-dH2)^2 }^0.5 式（1）
(dD項の前に4という係数がつく事に注意いただきたい。)
このHSP距離(Ra)が短いと，その試料は溶解しやすいと判断される。
そしてHPLCの場合には、移動相が混合溶媒である事が多い。混合溶媒の溶解度パラメータはベクトルの足し算で表現する。
混合溶媒のHSP
混合比率は体積で計算する。
溶媒１と溶媒２を体積比でa : b で混合すると、その混合HSPは
[dDm, dPm, dHm]=[(a*dD1+b*dD2), (a*dP1+b*dP2), (a*dH1+b*dH2)]/(a+b) 式(2)
で表す事ができる。
この混合溶媒のHSP，[dDm, dPm, dHm]と試料のHSP距離を(1)式で計算する事により，移動相への溶解性を評価する事ができる。
3. HPLCの分析結果
3.1. 紫外線吸収剤のHPLC分析
食品に添加されるプェノール性の酸化防止剤をHPLC分析した場合、下に示すチャートが得られる。
LC/MSなどを測定し標準チャートと比較すれば、どのピークがどの構造であるかは決定される。しかし、何故，３番(TBHQ)と５番(BHA)で溶出位置がこれほど異なるのかは、説明されていない。
解析をする為には、まず、化合物のHSP値を計算する。
溶媒のHSP値はポリマーハンドブックなどにも記載されているし、インターネットを探せば出てくる。
しかし、酸化防止剤のHSP値が記載されている文献は、残念ながら見当たらない。
その場合には、HSPiPというソフトウエアーを使って計算する。
これはHansen先生、Abbott先生と私（山本博志）が開発したオフィシャルなソフトウエアーで、1200を超える溶媒、600を超えるポリマーのHSP値がデータベース化されている(ver. 3.0当時)。
HSPiPの物性推算機能、Y-MB
もし、データベースに無い構造であったとしても簡単に推算値が計算できる。ここでは、HSPiPの推算機能、Y-MBを使って酸化防止剤のHSP値を計算する。(画面はver.5.4のもの。GUIはバージョンによって異なる)
HSPiPを立ち上げて、DIYボタンを押すとウインドウが開くので、タブからY-MB（一番左）を選択する。
そして酸化防止剤のSmilesの式を入れて計算ボタンを押す。
自動的に分子を原子団に分割し、様々な物性を計算する。
このY-MB法は、データベースに無い化合物の推算値を計算する、オフィシャルな方法である。
その計算結果のうち、dD, dP, dHとMVolを控えておき、順番に他の化合物も計算する。
化合物の構造からSmilesの式を得るには、ChemDrawなどの分子描画ソフトには、Copy As の機能として搭載されているので利用する。HSPiPのver. 5.2ぐらいからはJSMEと言う分子描画ソフトが同梱されている。
分子を描いてSmilesアイコンをクリックすると、Smilesの構造式が得られるので、それをコピーする。
化合物の名称などがある場合に、その化合物のCAS#、Pubchem番号を調べたいならこのサイトがおすすめだ。
一括で変換する機能(Batch)もあるので、化合物の名称の列をペーストするとCAS番号などに変換できます。
Pubchem CID, CAS#などがあるのであれば、このサイトでSMILESに変換できる。
計算結果をまとめると下のようになる。
これはver.3.0での計算結果なので、最新版でやってみよう。
次に、溶離液のHSP値と固定相のHSP値を定める。
HSPの場合、溶離液が混合溶媒であっても、そのHSP値はベクトルの足し算で簡単に計算できる。
このHPLCの溶離液はMeOH/CH3CN/水/CH3COOH=0.2/0.2/0.57/0.03なので、[15.27, 15.42, 30.196]になる。
また固定相はオクタデカンのHSP [16.4, 0, 0]を使うことにする。
結果の相関
次にHSP距離の計算式を使って各酸化防止剤とオクタデカンの距離を計算する。
それをプロットするとのようになる。
固定相オクタデカンからのHSP距離が長くなる化合物は、早く流出する。
HSPの考え方の基本では、HSP距離が長いというのは、ベクトルの向き、大きさが違っている事を表す。
つまり、オクタデカンに溶解しにくいものは小さい保持時間になる事がわかる。
模式図にも書いたように、固定相のODSと相互作用せず、すぐに出てきてしまうと考えればよい。
それに対して、分子中にドデシル基やt-Butyl基を持つものなどは、HSPがオクタデカンに近くなり、HSP距離が短く、固定相に溶解しやすいので保持時間が長くなる。
線が２本あるように見える。これはフェノール性の水酸基が３以上と以下で分離する。
また、酸化防止剤の分子の大きさにも起因している。
そこで、HSP距離を分子の体積で割ったものをプロットすると、下図に示すようになる。
先ほどの２本線はかなり近づき，分子体積による補正が有効である事がわかる。
次に、溶離液の方から検討する。
この場合は分子体積の効果は,かけ算になることに注意いただきたい。
溶離液からのHSP距離の短いものほど、保持時間が小さい事が分かる。
HSP距離の短いものは、溶離液に良く溶解する事を示している。
以上のように、固定相に溶けやすいものは遅く、溶離液に溶けやすいものは早く出てくる事が、HSPから理解される。
3.2. 坑てんかん薬のHPLC解析
3.3. 応用
ピークの分解能を上げるには？
別ページで説明
4. GC分析
ガスクロ分析
別ページで説明
4.2. 応用例
ICH勧告の医薬品合成用溶媒
別ページで説明する。
昔の記述
ある化合物を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で解析したとき、化合物がどの順番に検出されるか、予想がつきますか？
例えばフェノール性の酸化防止剤を９つ、HPLC分析した場合、下のようなチャートが得られます
LC/MSなどをとって標準チャートと比較すれば、どのピークがなんであるかは分かると思いますが、何故３番(TBHQ)と５番(BHA)で溶出位置がこんなに違うのでしょう？
我々はその原因を”溶解度”だと考えています。
HPLC分析で一番多く使われているカラムはODSカラムでしょう。
これは微細なシリカゲルの表面をオクタデシルシランで修飾したものです。
ここに溶離液に溶かした試料を流します。
すると、オクタデシル基に溶けやすいものは、カラムの充填剤と強く相互作用して遅く出てきます。
同時にキャリアーに溶けやすいものは早く出てきます。
それでは、こうした溶解性の大小はどのように評価することができるでしょうか？
溶解度パラメータ（SP値）というのは聞いた事があるでしょうか？
特にポリマーの研究分野では一般的なのですが、分析の分野ではなじみが無いかもしれません。
概要についてはこちらのページを参照ください。
このハンセンの溶解度パラメータというものを使うと、クロマトグラフィーは次のように考えることができます。
クロマトグラフィー
ハンセンの溶解度パラメータ（HSP)は、3次元のHSPベクトルの類似度で、溶解性を評価します。
例えば下の図で、溶質（オレンジ）のベクトルが、有機溶媒のHSPベクトル（青）と水のHSPベクトル（黄色）とどちらに近いかをHSP距離で評価します。
HPLCのシミュレーションは、これが横に長くなり、液液抽出が連続的に繰り返されていると考えます。
そこで、溶質のHSPベクトル（オレンジ）が有機相のHSPベクトル（青）に近い場合、なかなか出てこない、つまりリテンションタイムが長くなると判断し、逆に、水のHSPベクトル（黄色）に近い場合、保持時間は短くなると判断します。
ここで行うシミュレーションは有機層がオクタデカンとしているので、HPLCカラムとしては、ODSカラム相当になります。
また、これまでの検討で、分子の体積の補正が有効であることが解っています。
まず、最初にやる事は、化合物のHSPを計算します。
溶媒のHSP値はポリマーハンドブックなどにも記載されていますし、インターネットを探せば出てきます。
しかし、酸化防止剤のHSP値は、まず、出てこないでしょう。
そのような場合には、HSPiPというソフトウエアーを使います。
1200を超える溶媒、600を超えるポリマーのHSP値がデータベース化されていますし、もしデータベースに無い構造であっても簡単に推算値が計算できます。
ここでは、HSPiPの推算機能Y-MBを使って酸化防止剤のHSP値を計算します。
次に、キャリアーのHSP値と固定相のHSP値を定めます。
ハンセンの溶解度パラメータの場合、溶離液が混合溶媒であっても、そのHSPはベクトルの足し算で簡単に計算できます。
このHPLCのキャリアー溶媒はMeOH/CH3CN/水/CH3COOH=0.2/0.2/0.57/0.03ですので、[15.27, 15.42, 30.196]になります。
また固定相はオクタデカンのHSP [16.4, 0, 0]を使うことにします。
次にHSP距離の計算式を使って
酸化防止剤とオクタデカンの距離を計算します。
HSP距離
HSP distance(Ra)={4*(dD1-dD2)^2 + (dP1-dP2)^2 +(dH1-dH2)^2 }^0.5
(dDの前には４と言う係数が入ることに注意しましょう。)
octadecaneからの距離が長くなると、早く流出する事が分かります。
HSPの考え方の基本ですが、距離が長いというのは、ベクトルの向き、大きさが違っている事を表します。
つまり、octadecaneに溶解しにくいものは早いRetention timeになる事がわかります。
それに対して、分子中にドデシル基やt-Butyl基を持つものなどは、HSPがoctadecaneに近くなり、距離が短く、固定相に溶解しやすいので保持時間が長くなります。
中略
対応するブラウザーをお使いなら、上のキャンバスに分子を複数描けばRTがどのくらいかを得る事ができます。詳しい分子の描き方はこちらを参照してください。
この事から考えると、もし、似た位置に出てくる化合物のRTをなるべく広げたい時にどんな混合溶媒を使ったらいいか？などの知見も得られます。
例えばTHBPとTBHQのリテンションタイムを広げるには、固定相のHSPは同じですから、キャリアーのHSPだけが変えられます。
片方のベクトルに近く、もう片方からは遠いものを選べば、HSPの効果が最大になります。
それでは、 [18.1, 8.8, 20.6]や [16.9,6.4,13.7]といったHSPの溶媒はどうやって手に入れたらいいのでしょうか？
HSPiPには”Solvent Optimizer”という機能がついているので、目標とするHSPを入れて計算ボタンを押すだけで、どの溶媒をどんな比率で使ったら良いのかたちどころに計算してくれます。
(詳しい説明はこちらを参照してください。)
このように、HSPはクロマトグラフィーの解釈に非常に役に立つ。
また、こうした結果がリーズナブルな場合、再結晶溶媒、抽出溶媒の選択に非常に役に立つ。
詳しくは、HSPiPに搭載のe-Book 16章をご参照いただきたい。
メカニズムについては，液液抽出に関する記事が参考になる。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
2011.11.19
別ページで説明する。
実際のやり方 2011.2.22
具体的にはどうやるんだ？というユーザーからの質問が多いので、やり方を記しておく。
まず最初に計算したい化合物のSmilesの構造式を準備する。
例えばChemSpiderのホームページへ行き、CAS番号や名称から検索して、Smilesをコピーし表計算ソフトを使ってまとめておく。
そして、以下のようなテーブルを作る。（これは前半においてあるので、エクセルにコピペしておく。）
テーブル
| name | CAS# | Smiles | |
| PG | Propylgallate | 121-79-9 | O=C(C1=CC(=C(C(=C1)O)O)O)OCCC |
| THBP | 2,4,5-Trihydroxybutyrophenone | 1421-63-2 | CCCC(=O)C1=C(C=C(C(=C1)O)O)O |
| BHA | Buthylated Hydroxyanisole | 25013-16-5 | OC1=CC=C(C=C1C(C)(C)C)OC |
| HMBP | 4-Hydroxymethyl-2,6-di-tert-buthylphenol | 88-26-6 | OC1=C(C(C)(C)C)C=C(C=C1C(C)(C)C)CO |
| OG | Octyl gallate | 1034-01-1 | OC(=C(C(=C1)O)O)C=C1C(=O)OCCCCCCCC |
| BHT | Buthylated hydroxytoluene | 128-37-0 | CC(C=C1C(C)(C)C)=CC(C(C)(C)C)=C1O |
| DG | Dodecy lgallate | 1166-52-5 | OC(=C(C(=C1)O)O)C=C1C(=O)OCCCCCCCCCCCC |
| TBHQ | tert-Bubylhydroquinone | 1948-33-0 | OC(C=C1C(C)(C)C)=CC=C1O |
| NDGA | Nordihydroguaiareticacid | 500-38-9 | Oc1ccc(cc1O)CC(C)C(C)Cc2ccc(O)c(O)c2 |
そして、HSPiPを立ち上げ、メインパネルのDIYボタンを押すと、DIYパネルが現れる。そこで、Y-MBタブを選択する。
(画面はver.3.0のもの。GUIはバージョンによって異なる）
そこで、テーブルからひとつSmilesをコピーし、テキストフィールドにペーストし、計算ボタンを押す。
すると、Y-MBが分子を官能基に分解し、いろいろな物性を計算する。
このうち、dD, dP, dHとMVolの値を控えておく。（これを一括でやりたい場合には、DBのインポートの記事を参照していただきたい。）
| RT | dD | dP | dH | Vol | |
| PG | 2.8 | 17.5 | 6 | 21 | 166.6 |
| THBP | 3.8 | 17.7 | 8 | 18.3 | 157.7 |
| BHA | 7.6 | 17.4 | 7 | 10.8 | 182 |
| HMBP | 8.8 | 16.8 | 6 | 9 | 240.3 |
| OG | 9.4 | 16.9 | 3 | 18.1 | 249.9 |
| BHT | 13.2 | 16.61 | 3.28 | 6.09 | 241.85 |
| DG | 13.5 | 16.6 | 2.9 | 15.7 | 316 |
| TBHQ | 4.3 | 17.3 | 7.2 | 16 | 161.5 |
| NDGA | 6.6 | 18.8 | 6.1 | 17.4 | 257.1 |
するとすぐにこのようなテーブルが作れるだろう。次にオクタデカン[16.4, 0, 0]からのHSP距離を求める。（最新バージョンでやってみよう）
この距離が短いほどオクタデカンに溶解しやすいという指標になる。
| RT | sqrt(4*(dD-16.4)^2+(dP-0)^2+(dH-0)^2) | Vol | |
| PG | 2.8 | 21.95 | 166.6 |
| THBP | 3.8 | 20.14 | 157.7 |
| BHA | 7.6 | 13.02 | 182 |
| HMBP | 8.8 | 10.85 | 240.3 |
| OG | 9.4 | 18.37 | 249.9 |
| BHT | 13.2 | 6.93 | 241.85 |
| DG | 13.5 | 15.97 | 316 |
| TBHQ | 4.3 | 17.64 | 161.5 |
| NDGA | 6.6 | 19.05 | 257.1 |
そして、HSP距離を分子体積で割った値を用意する。
| RT | Dis/Vol | |
| PG | 2.8 | 0.132 |
| THBP | 3.8 | 0.128 |
| BHA | 7.6 | 0.072 |
| HMBP | 8.8 | 0.045 |
| OG | 9.4 | 0.074 |
| BHT | 13.2 | 0.029 |
| DG | 13.5 | 0.051 |
| TBHQ | 4.3 | 0.109 |
| NDGA | 6.6 | 0.074 |
これをプロットすれば下のようなグラフになる。
Drag=回転, Drag+Shift キー=拡大、縮小, Drag+コマンドキーかAltキー=移動。
溶媒をクリックすれば溶媒の名前が現れる。
緑色の球はオクタデカンを示している。どの酸化防止剤がオクタデカンに近いか溶媒をクリックして試してみて欲しい。
距離が長いものほど早く流出する。ただし、分子が大きいものはやはり早く流出する。またエステル基などの官能基が入る位置（端っこか真ん中か）によってはHSPは余り変わらなので正しく評価されないことは当然ある。それは今後の課題だ。
以上のように、Smilesの構造式とHSPiPがあれば、すぐにリテンションタイムを溶解度の観点から検討することができる。
V3.1.xでは水酸基の取り扱いが変わったので、さらに精度は高くなっていると思われます。
Y-MB2021では、水酸基が非常に多くなった時の補正が大きく変更になった。
2012.1.9
カラムをODSから変えた場合には、こう単純にはいかないだろう。
自分だけのより精度の高い式を立てたいという要望があったので、YMBを使って自分用の式を構築する方法を、自分でやろう（DIY）の抽出を考えてみよう、のページにまとめたので興味のある方は参照していただきたい。
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